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[分享] 热诱导的抗原修复(antigen retrieval;AR)的可能机制

抗原修复(antigen retrieval;AR)是否可能?理论研究上尚未清楚,但是以高温、高
玉对常规固定石蜡切片进行抗原修复处理的实践表明,可以提高抗原—抗体阳性检测率,同时也可能会出现假阳性,现已广泛应用于免疫组织化学。尤其对原来仅表达在冰冻切片上的抗原,利用AR后极大部分抗体能用于常规甲醛固定的石蜡切片上,这对IHC回顾性研究和临床病理IHC鉴别诊断,肿瘤患者术后的预后检测及疗效评估和各种癌基因蛋白、转录调控因子、细胞凋亡因子等的检测均具有积极的意义。

    (一)AR的简单回顾
    自1893年Ferdinand Blum创立组织固定以来,为了避免甲醛固定对抗原决定簇的影响.许多研究者经过几十年的努力,发现没有一种固定液可对所有的抗原起保护作用,而且形态学保存上远没有甲醛好。为了很好解决这一矛盾,试图将破坏或交联的抗原进行逆转,这一直是从事IHC工作的目标,并进行了很多尝试,例如用酶消化暴露抗原决定簇,但不呈对所有的抗原检测都有效。Shi等(1991)根据20世纪40年代Fraenkel - Conrat等的研究结果,发现甲醛固定可使蛋白发生不同程度的交联,用高温(120~C)或强碱可使交联打开,首次提出了AR的概念。随后许多研究者的研究结果都证实了高温可使IHC的阳性检测率大大提高,原仅表达在冰冻切片上的大量抗体,都能用于常规甲醛固定的石蜡切片检测。为主Gown(1993)和Boon(1995)分别给予高度的评价,认为是一种新技术的革命和病理学的突破。

    目前有关AR的报道文献已超过上千篇,可概括为:理论上研究尚未清楚,但是以高温、高压对常规固定石蜡切片进行AR,可以提高抗原—抗体的阳性检测率,同时也会出现假阳性,其应用范围已超出IHC,例如TUNEL、ISH/FISH和DNA/RNA的三提。

    (二)抗原修复的可能机制
    由于当前对甲醛固定组织会发生什么样的化学反应,尤其是对蛋白质的立体构象会产生什么样的影响尚不十分清楚,因而,导致对抗原修复的机制也不十分清楚。可能的机制可归纳如下三条。第一,由于甲醛固定可使蛋白与甲醛、蛋白与蛋白、蛋白与核酸之间通过甲基之桥形成交联,抗原决定簇被遮蔽,可通过高温、盐缓冲液使交联的蛋白水解,断开交联。Beebe等(1999)的实验结果已证实,加温可以水解交联。他们用纯甘油作为抗原修复液,100℃加热10min,IHC检测存档的石蜡切片,结果6种标记物全部为阴性;当在纯甘油中二人10%蒸馏水后,结果在同一张切片上获得了满意的阳性结果。第二种观点认为组织用三醛固定时,会形成蛋白—甲醛—钙复合体,并遮蔽了抗原决定簇,可通过高温使钙离子释放。并与修复液中的钙螯合物—柠檬酸结合,使抗原决定簇暴露,这种假说也得到了实验的三实。Morgan等(1994,1997)用1%CaCiz作为抗原修复液,同样高温修复10min,IHC检测Ki67和血小板反应蛋白为阴性;用o.Olmol/L柠檬酸缓冲液进行抗原修复,获得了阳性结果。第三种观点认为,经甲醛固定后,可形成甲醛化蛋白的三维空间,加热后可恢复蛋三贡自然的三维空间,使抗原得以修复。抗原决定簇又称抗原表位(epitope),是与相应抗体特性结合的部位,决定和控制抗原特异性的特殊化学基团,其抗原蛋白受到甲醛固定而使蛋白质三维结构发生改变,氨基酸侧链上的咪唑和吲哚基团(抗原活性基团)受到遮蔽,而影响抗原—抗体的结合。除了上述三种机制外,可能还存在其他的AR机制。作者认为,在一个具有三维空间结构的天然蛋白质抗原分子中,由于存在于抗原分子表面的抗原决定簇易被抗体分子识别,从分子的立体构型来看,这些抗原决定簇常分布于抗原分子表面突出的位置上,即肽链的转角或末端;而有些抗原决定簇则被抗原分子本身掩盖在、内部,正常情况下不能被抗体分子识别,当用高温加热时,使蛋白质三维空间构象发生改变,使遮蔽的抗原决定簇暴露。这一点可以解释为什么某些抗原在冰冻切片上检测不到,而采用高温处理后,石蜡切片能得到很好地显示。另外,某些非交联剂固定的细胞涂片也用AR,获得了很好的结果。根据实践经验认识到,以上几种修复机理可能同时存在,也可能在不同条件下存在不同AR机理,这可能导致不同抗原检测需不同AR的条件。

 

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