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[分享] Dot-IGSS检测牛结核血清抗体

(一)材料与试剂
1.抗原  牛结核PPD。
2.血清  待检血清、标准结核阳性血清和结核阴性血清。
3.硝酸纤维膜  孔径0.45µm。
4.氯化金(优质)
5.0.2Mol/L PB液
6.0.05Mol/L Tris—HCl缓冲液
7.硝酸银显影液(现用现配)
   明胶(20g/L)                   6.00ml
   对苯二酚(57.90g/L)            3.00ml
   硝酸银(25g/L)                 0.20ml
   pH3.5柠檬酸盐缓冲液             1.00ml
   对苯二酚和硝酸银溶液需避光保存,临用前将明胶加热溶解后,按上述比例依次混合。
   pH3.5柠檬酸盐缓冲液的配制:
   柠檬酸(C6H8O7·H2O)            25.50g
   柠檬酸三钠(C6H5Na3·2H2O)      3.50g
   去离子水                加至    100.00ml
   溶解后即可使用。
8.定影液
   硫代硫酸钠(Na2S2O3)            20.0g
   去离子水             加至       100.00ml
   溶解即可。
9.兔抗牛IgG抗体。
(二)操作方法
    1.胶体金的制备  试验用水均要求三蒸馏水并过去离子柱,最终去离子水的电阻大于100万Ω。所有容器最终均用去离子水清洗。
   (1)采用鞣酸—枸橼酸钠还原法制备
   A液  1%HAuCl4                   2.00ml
        去离子水                    158.00ml
   B液  1%枸橼酸钠                 8.00ml
        0.1%Mol/L K2CO3            0.20ml
        1%鞣酸                     0.20ml
        去离子水                    31.60ml
   将A液和B液分别于60℃水浴30min,并不时搅拌,迅速将B液加入至A液中,搅拌,颜色为深蓝色,继续加热至100℃,5 min~10min,溶液颜色变为深红色,自然冷却后4℃保存。
   (2)胶体金鉴定:外观呈深红色、晶莹透亮,迎着日光可见有光带。电镜观察胶体金粒子大小平均为10nm,颗粒大小一致,分布均匀。
    2.胶体金与兔抗牛IgG用量比例的确定  每ml胶体金所需的最低稳定蛋白量是30µg,根据试剂用量增加20%,所以每ml胶体金所需的最低稳定兔抗牛IgG量为36µg。
    3.金标记兔抗牛IgG的制备  取所需量的兔抗牛IgG,加入少许去离子水,用0.1Mol/L K2CO3溶液调pH值为9.0(用精密pH试纸测定),同时胶体金溶液的pH值也调至9.0。在磁力搅拌下,将20ml胶体金溶液加入至兔抗牛IgG中,继续搅拌10min,加入3.5ml 3%的聚乙二醇(分子量20 000)作为稳定剂,以使其最终浓度达到0.05%,再搅拌15min后,置4℃冰箱保存备用。
    4.金标兔抗牛IgG的纯化  将金标记的兔抗牛IgG以2 500r/min离心15min,以除去胶体金的聚合物,取上清以65 000g离心1h,可见离心物分为三层,上层为淡黄色,含有未结合的兔抗牛IgG,下层为近黑色,是尚未结合的胶体金颗粒,最主要的中间层为红色,是结合良好的金标记的兔抗牛IgG,倾去上层,收集中层液,用含0.1%BSA的0.01Mol/L pH8.2PB混合至原体积的1/10,过滤除菌,分装,4℃保存备用。
    5.金标记兔抗牛IgG的鉴定
   (1)颗粒大小及均匀度鉴定:取少许金标记的兔抗牛IgG,负染,电镜观察颗粒大小及均匀度,并测量粒子直径大小。
   (2)活性鉴定:将牛IgG点样于硝酸纤维膜上,直接加金标兔抗牛IgG抗体,应显示出明显的粉红色斑点。
    6.正式试验程序
   (1)点样  以打孔器将微孔滤膜制成直径3mm的膜片。将牛结核PPD用0.01Mol/LpH9.0PBS液稀释为40µg/ml,用微量加样器加1µl抗原于膜片中央,37℃烘干10min。
   (2)封闭  将膜片置于0.01Mol/L pH7.4含0.2%BSA的PBST液中,37℃作用45min,其间振荡数次。取出后以蒸馏水洗涤1次,用滤纸吸干。
   (3)加待检血清  待检血清以PBST液做1︰160倍稀释。将膜片浸入其中,37℃作用1h,其间振荡数次。取出后,以PBST液洗涤后,滤纸吸干。此步同时设标准阳性血清和阴性血清对照。
   (4)加金标抗体  以PBST液将金标液作1︰10稀释,将膜片浸入其中,37℃作用2h,中间振荡数次。
   (5)银染  将膜片从金标液中取出,于去离子水洗涤3次,每次3min。然后将膜片浸入暗室中的银染色液中,室温下作用10min,移入定影液中,室温作用5min。然后用去离子水冲洗,自然干燥后观察结果。
(三)结果判定:
    +++~++++ :呈棕褐色或黑色斑点,着色深,均匀一致,与背景反差大。
    ++             :着色较深或着色很深,但背景色也较深。
    +               :着色淡,或着色较深,但有背景色。
    -               :没有着色,或与背景色没有反差。
    出现“++”以上,判为阳性结果,否则判为阴性结果。

 

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