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[分享] 单克隆抗体的克隆化方法

经过抗体测定的阳性孔,可以扩大培养,进行克隆,以得到单个细胞的后代分泌单克隆抗体。克隆的时间一般说来越早越好。因为在这个时期各种杂交瘤细胞同时旺盛生长,互相争夺营养和空间,而产生指定抗体的细胞有被淹没和淘汰的可能。但克隆时间也不宜太早,太早细胞性状不稳定,数量少也易丢失。
    克隆化的阳性杂交瘤细胞,经过一段时期培养之后,也还会因为细胞突变或特定染色体的丢失,使部分细胞丧失产生抗体的能力,所以需要再次或多次克隆化培养。克隆化次数的多少由分泌能力强弱和抗原的免疫性强弱而决定。一般说,免疫性强的抗原克隆次数可少一些,但至少要3~5次克隆才能稳定。
克隆化的方法很多,包括有限稀释法、显微操作法、软琼脂平板法及荧光激活分离法等。
   (一)有限稀释法
    1.材料
   (1)微量培养盘,盘内各孔于克隆化前一天培养小鼠腹腔细胞(即饲养细胞)每孔2万~4万。
   (2)HT培养基
    2.操作方法
   (1)取出抗体阳性孔细胞,用HT培养液制成细胞悬液。并取样进行台盼兰染色,计数。
   (2)用HT培养液将细胞稀释成200个/ml、40个/ml、20个/ml和的悬液。
   (3)用吸管将细胞悬液分别种入微量培养盘,每孔0.05ml,细胞含量分别为10个/孔、2个/孔、1个/孔和0.5个/孔。
   (4)5%CO2饱和湿度,37℃培养。
   (5)每天用倒置显微镜观察克隆生长情况,选择只有一个集落生长的孔,弃掉两个以上和没有细胞生长的孔。
   (6)克隆大量繁殖后,布满孔底的1/3~1/2时,测培养液抗体。
   (7)抗体阳性孔细胞,移到有饲养层的组织培养瓶中,并传2~4代就可以脱离饲养细胞,建成克隆株。
   (二)软琼脂克隆化
    借助撒在软琼脂上单个细胞定位生长,而达到克隆化,具体操作如下:
    1.配2.5%的琼脂糖30ml,水浴溶化后,移入45℃水浴中。
    2.将117ml完全DMEM液和3ml 10倍浓度的DMEM液混合,置45℃水浴预热。
    3.将琼脂糖与DMEM液混合,即为含0.5%琼脂糖的完全DMEM液,并加75×108 脾细胞。
    4.每块平皿加10ml,于室温中凝固。
    5.DMEM中的细胞与DMEM—琼脂1:1混合,将细胞琼脂混合物2ml铺于凝固的平板上,使其全部覆盖。
    6.放入CO2箱饱和湿度,37℃培养10天。
    7.用PBS配制0.6%琼脂糖,于沸水浴溶解后,置45℃,在保温情况下取一试管,迅速加入0.1ml 25%羊红血球,0.2ml豚鼠补体,2.7ml 0.6%琼脂糖。
    8.用3ml琼脂糖—羊红血球混合液覆盖克隆。于37℃CO2箱孵育1h~2h。从克隆上部溶解羊红血球的溶血范围,可筛选抗羊红血球Ig。
    (三)显微镜操作法
    在直径6cm培养皿中,加入1ml 1.0×108细胞悬液放置5%CO2饱和湿度,37℃温箱中放置30min以上,倒置显微镜下,寻找那些与周围相距甚远的单个细胞,将毛细管口(一头有直角弯头毛细管,一头连接一尺长乳胶管,用口控制液体进入)水平置放于液面上,左右微动,直到看见管口,对准细胞,吸入毛细管,将管中细胞移到预先加有2.0×104~5.0×104饲养细胞96孔板内,培养后,即可获得单个细胞形成的克隆。
   (四)荧光激活分离法
用一种荧光激活细胞分类器(Fluorescein Activafed Cell Sorter,FACS)。其基本原理是:将细胞经荧光抗体染色后,经喷嘴形成单个细胞的线形液滴,在莱塞光激发下,荧光素发射荧光,此信号由光电倍增管接收,再结合细胞形态大小产生光散射信号,经电脑处理,产生信号并与预定的信号对比,根据细胞荧光强度及细胞大小不同,将细胞分成不同级别,在电场中发生偏离,而分别收集于不同容器中。

 

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