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[分享] 免疫球蛋白提取分离纯化技术

免疫球蛋白(Immunoglobulin Ig)的含量代表着机体体液免疫的水平,并进一步代表着B细胞的功能,因此测定血清Ig含量可以推知机体的体液免疫功能和诊断某些疾病引起的Ig的过高和过低。

    随着免疫学的发展和需要,免疫球蛋白的纯化和其成分的提纯成为必不可少的手段。纯化的方法很多,有单一法,但大多数采用二步法以上相结合的方法,特别是以硫酸铵提纯为基础,再经过层析柱的方法来提高免疫球蛋白及其各成分的纯度最为常用。

    硫酸铵溶液能使蛋白质胶体脱水并中和其电荷而使之沉淀下来(称为盐析)。不同浓度的硫酸铵盐析蛋白成分不同,利用这一原理提取所需的免疫球蛋白成分。盐析只能粗提,为了获得纯化的免疫球蛋白成分,必须进一步采用层析的方法进行分离。

    免疫球蛋白包括IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。例如:
   禽血清IgG的分离与提纯(Na2SO4法)
    1.试剂
    ⑴ 5%葡聚糖硫酸盐
    ⑵ 0.02Mol/L MnCl2溶液
    ⑶ 无水硫酸钠
    ⑷ pH8.2硼酸盐缓冲液
    ⑸ 0.06Mol/L pH7.4PB液
    2.操作方法
    ⑴ 取禽血清10ml加5%葡聚糖硫酸盐液,0.40ml和0.025Mol/L MnCl21.00ml充分混合,静置,然后离心去沉淀,此步目的是为了去掉脂类物质。
    ⑵ 于上清液中加无水硫酸钠使每毫升血清含0.18g,缓慢加入,混匀,静置30min,3 000r/min离心去上清。
    ⑶ 以pH8.2硼酸盐缓冲液将沉淀稀释至原血清的一半再加硫酸钠使成0.16g/ml,同上法离心去上清。
    ⑷ 重复步骤⑶,加Na2SO4,使成0.14g/ml。
    ⑸ 以少量硼酸盐缓冲液溶解沉淀,然后装透析袋除盐48h。
    ⑹ 过SephadexG200柱,收集第一峰和第二峰。第一峰是IgM,第二峰主要是IgG。
    ⑺ 如要进一步提纯,则用第二峰再过DEAE—纤维素柱,以0.06Mol/L pH7.4 PB液洗脱,洗脱下来的蛋白液即为IgG。
    也可以按以下操作方法进行:
    ⑴ 以18%硫酸钠(W/V)提取一次,再以14%的硫酸钠提取一次。
    ⑵ 将粗提的免疫球蛋白以PBS溶解,按9%加入无水硫酸钠,离心。再将上清按5%加入无水硫酸钠,离心。将两沉淀溶解、混合,在常水中透析过夜,再在生理盐水中4℃透析,直至无SO42-为止。
    ⑶ 离心将上清液以pH8.0 0.20Mol/L PBS液平衡。
    ⑷ 过SephadexG200柱,以pH8.0 0.20Mol/L PBS液洗脱,收集洗脱液,取第二峰即为鸡IgG。

    禽IgA提取与纯化
   (一)材料与试剂配制
    1.禽胆汁
    2.饱和硫酸铵溶液
    3.0.01Mol/L pH7.4PBS液
    4.0.10Mol/L pH6.4PBS液(0.30Mol/L NaCl)
    5. DEAE52-纤维素
   (二)操作方法
    1.取冷藏的胆汁3Ⅹml,缓慢滴加Ⅹml饱和硫酸铵液,边加边搅拌,使成25%饱和硫酸铵液。4℃放置30min。
    2. 3000r/min离心30min,去沉淀。
    3. 取上清,加饱和硫酸铵液,使成35%的饱和度,4℃放置30min。
    4. 3000r/min离心30min,弃上清。
    5. 取沉淀,加0.85%NaCl液溶解,加饱和硫酸铵溶液,重复步骤3和4三次。
    6. 将沉淀用0.85%NaCl液溶解,装入透析袋,以0.01Mol/L pH7.4PBS液透析。
    7. 以0.01Mol/L pH7.4PBS液平衡,过DEAE52纤维柱(20×250mm)。
    8. 取透析样品4ml(﹥20mg/ml蛋白浓度)加入层析柱。以0.01Mol/L pH7.4PBS液洗脱。
    9. 再用0.10Mol/L pH6.4PBS液(NaCl浓度为0.30Mol/L)洗脱,收集洗脱液。
    10.浓缩洗脱蛋白液至20mg/ml,分装,低温冰箱保存。

 

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