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[分享] 免疫共沉淀

一 原理:
    IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A"特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。
    实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同,免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。
    其次,要注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白,特别是骨架蛋白,缓冲液必须要使其溶解。为此,必须使用含有强界面活性剂的缓冲液,尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面,如用弱界面活性剂溶解细胞,就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果,抗原决定族被封闭,影响与抗体的结合,即使IP成功,也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。
    再次,为防止蛋白的分解,修饰,溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂,低温下进行实验。
    每次实验之前,首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原,过多则就不能沉降在beads上,残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原,过多则抗原被稀释。欲速则不达,确定好比例很必要。(待续)
    二 准备:
    器械:    微量高速冷冻离心机    移液枪    旋转盘    电泳设备    vortex震荡器
    液氮及组织粉碎器    eppentube
    试剂:    细胞或组织    蛋白定量kit    SDS电泳试剂    抗体(单抗时选择protein G,二抗选择抗鼠Ig兔血清)    PBS    NaN3    proteinA sapharose
    试剂配制
    抗原蛋白溶解缓冲液
    1.RIPA缓冲液 (最终浓度)
    1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM)
    5MNacl 15ml (150mM)
    0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM)
    20%TritonX-100 25ml (1%)
    10% DOC 50ml (1%)
    10%SDS 5ml ( o.1%)
    TLCK 18.5mg (0.1mM)
    TPCK 35mg (0.2mM)
    DDW 395ml
    toal 500ml
    另外,使用之前加1mMPMSF(PMSF溶在酒精,浓度100mM,-20度遮光保存。注意不易溶于水)
    2.NP40 lysis 缓冲液
    1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM)
    5MNacl 15ml (150mM)
    0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM)
    20%NP40 25ml (1%)
    TLCK 18.5mg (0.1mM)
    TPCK 35mg (0.2mM)
    DDW 450ml
    toal 500ml
    使用前加1mM的PMSF
    注意点:
    *Tris缓冲剂PH随温度变化,高浓度盐酸滴定时发热,冷却后PH增高。
    *反复使用PMSF要注意保管方法。
    *1和2的缓冲剂的区别在于界面活性剂。TritonX-100,NP40是非离子界面活性剂,作用温和,,DOC
*两方都有EDTA,对抗原而言,二价离子Mg,Ca等是必要的。根据自己需要调节。EDTA用NaOH滴定。
    Protocol
    1. 调制protein A sapharose
    protein A sapharose 5ml 溶于20ml含0.02%NaN3的PBS
    离心2000转2分,去上清,在沉淀加0.02%NaN3的PBS,离心后去上清,重复2次,最后沉淀加20ml含0.02%NaN3的PBS,冷藏保存
    用单抗做一抗时,把protein A sapharose先用抗鼠Ig兔血清处理(每50ulprotein A sapharose用1-5ul血清)。旋转1-2h,混匀后,再离心1-2s去上清后,加PBS,vortex混合,离心去上清,重复二次加含0.02%NaN3的PBS到原来体积,冷存。避免长期保存。
    2.抗原的检出
    以下操作全在冰面或4度进行去除细胞培养液,用冷PBS洗一次。加RIPA,溶解后,转移到eppentube中用vortex混匀。RIPA的量:6cm的培养皿加1 ml(蛋白质的量为500mg/ml),组织块用液氮粉碎,在缓冲剂中捣匀,蛋白定量。
    30m,15000rpm离心,上清转移到新tube 。不用移液枪,直接从tube倒进另一个tube
往上清加抗体,1ml加2-5ul抗体,冷室内旋转混匀1h加protein A sapharose50ul,再混匀1h5000rpm离心1s,使sapharose沉淀,去上清。往sapharose加RIPA,vortex 混匀,离心,去上清。重复4次洗净。
    加电泳用 sample 缓冲液40ul,2m煮沸,泳动后,固定/干燥胶,现像。
    3.注意点
    A:不熟练使用移液枪,会混入沉淀的不溶性蛋白,使实验失败。对无论怎么也除不去的混入蛋白,只使用上清的上半部,或用超速离心机。
    B:对电泳的非特异条带,最后可依次用含300mM,1omMNaCl的RIPA洗净各一次。(完)
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