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[分享] 石蜡切片免疫组化染色步骤

1、载玻片的处理:
    抗原修复过程中,由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响,极易造成脱片。为保证试验的正常进行,可选用我公司提供的ZLI-9001 APES、ZLI-9003 HistogripTM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等几种试剂,对已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下:
    1.1 APES:现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中,停留20~30秒钟,取出稍停片刻,再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES,置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位,并尽量减少气泡的存在,以免影响染色结果。
    1.2 HistogripTM:将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液中,停留1~2分钟,然后用双蒸水快速清洗三次,室温干燥或60oC烤箱烘烤一小时,装盒备用。
    1.3 Poly-L-Lysine:将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中,浸泡5分钟,60oC烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。
    2、常用酶消化:
    2.1 胰蛋白酶:一般使用浓度为0.05%~0.1%,消化时间为37℃、10~40分钟,主要用于细胞内抗原的显示。
    2.2 胃蛋白酶:一般使用浓度为0.4%,消化时间为37℃、30~180分钟,主要用于细胞间质抗原的显示,如:Laminin(层粘蛋白),Collagen IV(IV型胶原)等。
    2.3 g/ml的saponin溶液,消化时间为室温孵育30分钟。m皂素(Saponin):一般使用浓度为2~10
    3、抗原热修复:
可根据实验室的具体条件,选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液,如TBS、PBS、重金属盐溶液等,但实验证明,以0.01M枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)效果最好。请选用我公司提供的ZLI-9064 ±枸橼酸盐缓冲液(粉剂)配制,取该粉剂一包溶于1000ml的蒸馏水中,混匀,其pH值在6.0 0.1,如因蒸馏水本身造成的pH值偏差,请自行调整。
    3.1 石蜡切片微波炉抗原修复操作方法:切片脱蜡至水后,3%H2O2处理10分钟,蒸馏水洗2分钟×3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液(工作液)的容器中,置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃~98℃之间并持续10~15分钟(注意:无论是使用医用或家用微波炉,请根据具体机型酌情设置条件,务必满足以上步骤中对温度和时间的要求)。取出容器,室温冷却10~20分钟(注意:不可将切片从缓冲液中取出冷却,以便使蛋白能够恢复原有的空间构型)。PBS洗,下接免疫组化染色步骤。
    3.2 石蜡切片高压抗原修复操作方法:切片脱蜡至水。将1500ml~3000ml的枸橼酸盐缓冲液(工作液)注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上,放入锅内,使切片位于液面以下,盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时(约加热5~6分钟后),计时1~2分钟,然后将压力锅端离热源,冷水冲至室温后,取下气阀,打开锅盖,取出切片,蒸馏水洗后,PBS洗2分钟×3,下接免疫组化染色步骤。
    3.3 石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法:切片脱蜡至水后,放入盛有枸橼酸盐缓冲液(工作液)的容器中,并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中,电炉上加热煮沸,从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15~20分钟,然后端离电炉,室温冷却20~30分钟,蒸馏水冲洗,PBS洗,下接免疫组化染色步骤。
    4、免疫组化染色步骤:
   (以美国ZYMED公司SP试剂盒为例)
    1)石蜡切片脱蜡至水。
    2)3%H2O2室温孵育5~10分钟,以消除内源性过氧化物酶的活性。
    3) 蒸馏水冲洗,PBS浸泡5分钟,(如需采用抗原修复,可在此步后进行)。
    4) 5~10%正常山羊血清(PBS稀释)封闭,室温孵育10分钟。倾去血清,勿洗,滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液,37℃孵育1~2小时或4℃过夜。
    5)PBS冲洗,5分钟×3次。
    6)滴加适当比例稀释的生物素标记二抗(1%BSA-PBS稀释),37℃孵育10~30分钟;或滴加第二代生物素标记二抗工作液,37℃或室温孵育10~30分钟。
    7)PBS冲洗,5分钟×3次。
    8)滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(PBS稀释),37℃孵育10~30分钟;或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液,37℃或室温孵育10~30分钟。
    9) PBS冲洗,5分钟×3次。
    10) 显色剂显色(DAB或AEC)。
    11)自来水充分冲洗,复染,封片。
    冰冻切片免疫组化染色步骤
    室温放置30分钟后,入4℃丙酮固定10分钟,PBS洗,5分钟×3。用3%过氧化氢孵育5~10分钟,消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗,5分钟×2

 

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