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[分享] 2D电泳结果疑难解析

生命科学领域发生的革命性变化,对生命活动的研究正在从传统的还原式研究转向了整体性的研究——以基因组学(功能基因组学)和蛋白质组学为基础的系统生物学。其中蛋白质组学包括表达蛋白质组学(expression proteomics)、结构蛋白质组学(structural proteomics)和功能基因组学(functional proteomics)。而双向电泳则是蛋白质组学,尤其是表达蛋白质组学的经典方法。

由于双向电泳对于许多研究人员来说是个陌生的技术,所以一旦在电泳染色后出现费解的电泳图是件令人头痛的事:不知道问题出现在哪,也不知道如何去改正。这里来自GE公司的专家列出了几种常见出错电泳图,虽然不是非常全面,但是如果您也在实验中遇到了这样的问题,希望能从这里得到参考。

首先,来看看漂亮的2D电泳图

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问题1. 氨基甲酰化(Carbamylation trains)导致太多蛋白斑点串,不属于常规的磷酸化等修饰

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可能原因:尿素(urea)不纯
建议:用更纯的尿素,避免样品加热,或者用Amberlite IRN-150L去异氰酸盐(isocyanate)


问题2. 蛋白样品制备步骤错误导致蛋白丢失

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可能原因:样品制备TCA/丙酮沉淀后用预冷的丙酮洗涤沉淀,导致TCA残留
建议:用90%丙酮/10%H2O洗涤,可以彻底洗去TCA


问题3.不同的样品制备步骤导致完全不同的蛋白斑点图谱
    对于样品制备而言,没有一个固定的方法,更多的时候要根据样品的特性,以及一些文献的参考进行优化,下面是一个植物样品的例子:
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若采用常规的标准裂解液,样品溶解不充分用甲醇沉淀后复溶,效果也不明显TCA/丙酮沉淀较适合这一样品



4.正常情况

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正常情况,右边的垂直条带包含了所有pIs值>pH7的蛋白。



问题5. 样品含高丰度蛋白导致出现水平条带

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可能原因:高丰度蛋白聚集后,若采用胶面朝下的胶条槽,易造成水平条带。
建议:采用杯上样胶条槽或manifold等胶面朝上的胶条槽。
 
问题6. 出现水平条带(窄pH范围胶条)

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可能原因:聚焦不够,或者盐离子过多

造成水平条带的其它原因:
  • Detergent去污剂浓度过低
  • 尿素浓度过低
  • DTT浓度过低,或者用量过少
  • 上样位置不合适(比如cup loading)
  • 蛋白酶活性
  • 胶条溶胀时间过短
  • 样品中含有不溶的蛋白(centrifuge 1 hr / 40,000 g)
  • 空气中的CO2



问题7. 试剂不新鲜

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可能原因:TEMED不新鲜。
建议:尽管TEMED用量很少,还是建议每年更换一瓶TEMED。
 
问题8.试剂质量影响蛋白斑点成像

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可能原因:Tris质量不好


问题9. 步骤错误导致蛋白丢失

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可能原因:蛋白转移电压过高(400V,18cm胶)——在开始的45分钟内不要超过2W/gel(Ettan size)


问题10. 植物样品制备

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可能原因:多糖未去除干净,被考马氏亮蓝染色
建议:样品用clean-up处理


问题11. 蛋白斑点出现垂直条带

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可能原因:平衡过程中DTT不足,导致一些蛋白出现垂直条带。


问题12 样品中含盐等离子过高

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可能原因:样品中含盐等离子杂质过高,导致等电聚焦失败。
建议:避免过多盐,需除盐,如在洗细胞时要把PBS在离心后彻底移除,或在最后一步清洗时采用250mM蔗糖/10mM Tris 洗细胞。


问题13 pH6-11的胶条

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Rehydration Loading Cup loading
建议:对于碱性pH范围胶条,用杯上样效果更好


问题14 保存第二向凝胶时温度太低

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可能原因:保存第二向凝胶时温度太低, SDS有沉淀
建议:长时间保存(2days - 2weeks)在4-8oC, 在二向进行前应提前把凝胶取出,室温放置。

如有更多问题,欢迎到讨论。(以上胶片由GE Healthcare专家提供)

 

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