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人Th1/Th2和Tc1/Tc2的检测

1.
检测原理

Th1 Th2 细胞均分泌多种细胞因子:

l
Th1 细胞主要分泌 IL-2IL-12IFN-γ TNF-β/;

l
Th2 细胞主要分泌 IL-4IL-5IL-6 IL-10

其中 IFN-γ Th1最特异分泌的细胞因子,IL-4 Th2 最特异分泌的细胞因子。虽然人们一直在努力寻找区分 Th1 Th2 的特异性的细胞表面标志,但迄今为止,还没有找到公认的细胞表面鉴别标志,所以仍以所分泌的细胞因子来区分 Th1 Th2,即:

Th1CD4+IFN-γ+,

Th2CD4+IL-4+

同理,Tc1 Tc2 也需用 IFN-γ IL-4 来区分,即:

Tc1CD8+IFN-γ+,

Tc2CD8+IL-4+

其实,我们通常所说的 Th1 Th2 是指 T 辅助细胞(严格意义上是 Th0 细胞)在各种生理与病理条件下分化为 Th1 Th2 的能力。静息状态(即未受任何刺激,如人的正常生理状态)下,Th0 分化为 Th1 Th2的能力非常弱,所以外周血中仅含有极少量的 Th1 Th2 细胞,这时我们所能检测到的 IFN-γ IL-4 也微乎其微。而当 Th 细胞受到外界因素,如刺激素,病原体等刺激,其中 Th0 即会向 Th1 Th2 大量分化,具体分化趋向取决于细胞因子的种类。此时,我们检测到的 IFN-γ IL-4 也较多。实验中我们检测的 Th1 Th2 实际上是检测 Th 细胞对刺激素刺激的反应能力。

我们通常选用的刺激素为 PMA(佛波酯)+ Ionomycin(离子霉素)

其中 PMA PKC(蛋白激酶 C)的激活物,PKC 则可激活下游众多的蛋白激酶的磷酸化,形成级联反应,导致许多蛋白的表达,进而引起 T 细胞的活化。在细胞内,PKC 可被 DAG(二脂酰甘油) Ca2+的共同作用而激活,因此在 Ionomycin(Ca2+的转运剂,可将细胞器内的 Ca2+转运至胞浆内)的参与下,T 细胞内 PKC 可被进一步激活。可见,PMA Ionomycin 协同活化 T 细胞。

也有人选用其它刺激剂来活化 T 细胞,如 CD3/CD28 协同刺激,PHA 刺激等。实验表明,PMA 为广谱性刺激,即 T 细胞中的各亚群均会被 PMA 同等激活,而 CD3/CD28 协同刺激和 PHA 刺激,则是通过TCR 受体的作用,仅对部分 T 细胞亚群有效。所以可根据实验的需要来选择刺激方式。

活化的 T 细胞可分泌多种细胞因子至细胞外,而流式细胞仪仅能检测细胞内的抗原,所以应阻断细胞因子分泌至细胞外。方法为破坏高尔基体(Golgi),因细胞因子(即各种蛋白)在合成后需经高尔基体的加工和转运,才能到达细胞膜,然后通过高尔基体膜与细胞膜的融合作用将细胞因子分泌至细胞外。因此破坏高尔基体即可切断细胞因子的转运途径,干扰其分泌。我们通常选用的阻断剂为 BFA Monensin,
其中BFA 的阻断效果优于 Monensin,
但由于前者价格较昂贵,现实验中多用 Monensin 来替代 BFA.

另外,实验过程中涉及到如何正确的选定Th( T辅助细胞) 的问题。
Th
细胞的表面标志为CD3+CD4+,而当用 PMA 刺激 4 小时时,会发现 CD4+的细胞明显减少,甚至消失,这是因为 PMA 会诱发细胞表面 CD4 分子被内吞[1,2]。所以通常的做法是用 CD3 CD8 反设 CD4 细胞,即 CD3+CD8-的细胞被认为是 CD3+CD4+的细胞。(注:PMA 对小鼠 CD4 的影响很小,所以检测小鼠 Th1/Th2 时可用 CD4直接设门)。此时,CD3+CD8+细胞正好可用来分析 Tc1 Tc2,所以该法能同时得出 Th1/Th2 Tc1/Tc2的比例。

2.
检测方法

【试剂】 

PMA

贮存液:PMA 溶于 DMSO,浓度为 0.1mg/ml-20oC 保存

工作液:贮存液 1:100 稀释于 RPMI 1640(不含小牛血清-FBS) PBS(无菌,无 NaN3)中,此时为 1μg/ml

工作浓度:25ng/ml

细胞培养:每 100μl 反应体系加工作液 2.5 μl 工作液

Ionomycin

贮存液:Ionomycin 溶于 DMSO,浓度为 1mg/ml-20oC 保存

工作液:贮存液 1:20 稀释于 RPMI 1640(不含小牛血清-FBS) PBS(无菌,无 NaN3)中,此时为 50μg/ml

工作浓度:1μg/ml

细胞培养:每 100μl 反应体系加工作液 2 μl 工作液

BFA(Brefeldin A)

贮存液:BFA 溶于 DMSO,浓度为 5mg/ml-20oC 保存

工作液:贮存液 1:10 稀释于 RPMI 1640(不含小牛血清-FBS) PBS(无菌,无 NaN3)中,此时为 0.5mg/ml

工作浓度:10μg/ml

细胞培养:每 100μl 反应体系加工作液 2 μl 工作液

Monensin

贮存液:Monensin 溶于甲醇,浓度为 50mg/ml,为加速溶解,可置于 40oC 43oC 水浴。4oC 保存至少 4个月工作液:贮存液 1:500 稀释于 RPMI 1640(不含小牛血清-FBS) PBS(无菌,无 NaN3)中,此时为 0.1mg/ml
工作浓度:1.7 μg/ml

细胞培养:每 100μl 反应体系加工作液1.7μl

RPMI1640

RPMI1640, 2mM glutamin50μg/ml penicillin50μg/ml steptomycin 100μg/ml neomycin

【抗体和破膜剂】 

三色法(BD Coulter 机器通用)

细胞表面标记抗体:CD3-TCCD8-FITC, CD69-PE

细胞内因子抗体:IL-4-PE, IFN--PE

同型对照:Rat IgG1-PE (对应于 IL-4-PE)Mouse IgG1-PE (对应于 IFN--PE), Mouse IgG2a-PE(对应于CD69-PE)

破膜剂:美国 Caltag 公司 Fix&Perm

四色法: 

l
BD(Becton Dickinson)流式细胞仪

细胞表面标记抗体:CD3-APCCD8-TC, CD69-PE

细胞内因子抗体:IFN--FITC, IL-4-PE

同型对照:Rat IgG1-PE (对应于 IL-4-PE)Mouse IgG1-FITC (对应于 IFN--FITC), Mouse IgG2a-PE ( 对应于 CD69-PE)

破膜剂:美国 Caltag 公司 Fix&Perm

l
Coulter 流式细胞仪

细胞表面标记抗体:CD3-TCCD8-PE-TR, CD69-PE

细胞内因子抗体:IFN--FITC, IL-4-PE

同型对照:Rat IgG1-PE (对应于 IL-4-PE)Mouse IgG1-FITC (对应于 IFN--FITC), Mouse IgG2a-PE ( 对应于 CD69-PE)

破膜剂:美国 Caltag 公司 Fix&Perm


【实验步骤】

l
标准检测法原理: 

Th1
Th2
的比率=(刺激的T细胞分泌的细胞因子比刺激的T细胞阴性对照比率) (未刺激T细胞分泌的细胞因子比率-未刺激 T
细胞阴性对照比率)

l
简易检测法原理:

因通常情况下,T
细胞在未受到刺激时所分泌的细胞因子非常少,可忽略不计,因此也可用下面的公式近似地表示 Th1 Th2 的比率。

Th1
Th2
的比率=(刺激的T细胞分泌的细胞因子比率刺激的T细胞阴性对照比率)

详细实验步骤: 

1.标本采集及制备

A.
血液标本用肝素抗凝管采集静脉血(必须用肝素钠抗凝,
不可用肝素锂、EDTA 或枸橼酸钠) 1-2ml,血液室温放置,8 小时内必须进行检测,否则需弃用。

B. PBMC(外周血单个核细胞)标本

1)
肝素抗凝管采集静脉血至少 2ml,采集后 4 小时内使用;

2)
加入等体积的 HBSS(Hank 平衡盐缓冲液, pH7.2-7.4)稀释血液;

3)
取与稀释后血液等体积的淋巴细胞分层液(Ficoll )加入离心管中;

4)
将稀释血液小心地加到淋巴细胞分层液上,注意保持两者界面清晰;

5)
室温下,2000 r/min,离心 20 分钟;

6)
用毛细吸管轻轻吸出单个核细胞层,加入含有 5ml HBSS 的试管中,充分混匀;

7)
1500 r/min
,离心 10 分钟,弃上清后,再洗一次;

8)
弃上清,用 RPMI 1640( 10%热灭活 FBS)重悬单个核细胞,用台酚兰染色计数活细胞数(应在 95%以上)

9)
调节细胞浓度为
2 x 106
细胞/ml

2.刺激及检测

a. 按标准检测法原理:

a.1
三色法

1)
全血标本:取 400ul 全血标本,用 RPMI 1640(不含小牛血清-FBS) 1:1 等体积稀释;PBMC 标本:取 800ul PBMC(2 x 106细胞/ml)

2)
取两只试管分别作为未刺激管(A)和刺激管(B),将上述标本等体积分配于两管中,即每管400ul

3)
A
管中加入:6.8µl 0.1mg/ml Monensin
工作液或 8µl
0.5mg/ml BFA
工作液;B 管中加入:10µl 1µg/mlPMA 工作液+ 8µl 50µg/ml Ionomycin 工作液+ 6.8µl 0.1mg/ml Monensin 工作液( 8µl
0.5mg/ml BFA
工作液),均需混匀

4) 37oC5% CO2培养箱培养 46 小时。(不能超过6个小时)

5)
混匀,A 管与 B 管中分别加入 20µl CD3-TC 20µl CD8-FITC,室温,避光孵育 15 分钟

6)
A 管与 B 管分别分成 4 管,每管加入 100µl 已染色的全血,
编号为 A1, A2, A3, A4 B1, B2, B3,B4

7)
每管中加入 100µl Fix&Perm 中的 Reagent A(即固定液),室温,避光孵育 15 分钟

8)
每管中加入 3mL PBS 1200 rpm 离心 5 分钟,弃除上清。(此时需用剩余的些许 PBS 轻轻震荡来重悬细胞,以免在后面的步骤中造成重悬细胞困难)

9)
每管中加入 100µl Fix&Perm 中的 Reagent B( 即破膜和溶血液),同时各管中按下表加入相应的抗体各10ul


10)室温,避光孵育15分钟。每管中加入3mL PBS 1200 rpm 离心5分钟,弃除上清

11) 0.5mL PBS 重悬细胞,上机检测

a.2
四色法

1)
全血标本:取 100ul 全血标本,用 RPMI 1640(不含小牛血清-FBS) 1:1 等体积稀释;PBMC 标本:取 200ul PBMC(2 x 106细胞/ml)

2)
取两只试管分别作为未刺激管(A)和刺激管(B),将上述标本等体积分配于两管中,即每管 200ul

3)
A
管中加入:3.4 µl 0.1mg/ml Monensin
工作液或 4µl
0.5mg/ml BFA
工作液;B 管中加入:5µl 1µg/mlPMA 工作液
+ 4µl 50µg/ml Ionomycin
工作液+ 3.4 µl 0.1mg/ml Monensin 工作液( 4µl 0.5mg/ml BFA 工作液),均需混匀

4) 37oC5% CO2 培养箱培养 46 小时。(不能超过 6 个小时)

5)混匀,A 管与 B 管中分别加入 10µl CD3-APC 10µl CD8-TC(BD 机器) 10µl CD3-TC 10µl CD8-PE-TR(Coulter 机器),
室温,避光孵育 15 分钟

6) A 管与 B 管分别分成 2 管,每管加入 100µl 已染色的全血,编号为 A1, A2 B1, B2,

7)
每管中加入100µl Fix&Perm 中的 Reagent A(即固定液),室温,避光孵育 15 分钟

8)
每管中加入3mL PBS 1200 rpm 离心 5 分钟,弃除上清。(此时需用剩余的些许 PBS 轻轻震荡来重悬细胞,以免在后面的步骤中造成重悬细胞困难)

9)
每管中加入100µl Fix&Perm 中的 Reagent B( 即破膜和溶血液),同时各管中按下表加入相应的抗体各 10ul


10)室温,避光孵育15分钟。每管中加入3mL PBS 1200 rpm 离心5分钟,弃除上清

11)0.5mL PBS 重悬细胞,上机检测。

b. 按简易检测法原理:

b.1 三色法

1)
全血标本:取 200ul 全血标本于试管中,用 RPMI 1640(不含小牛血清-FBS) 1:1 等体积稀释;PBMC 标本:取 400ul PBMC(2 x 106细胞/ml)于试管中

2)
加入 10µl 1µg/mlPMA 工作液
+ 8µl 50µg/ml Ionomycin
工作液+ 6.8µl 0.1mg/ml Monensin 工作液( 8µl 0.5mg/ml BFA 工作液),混匀

3) 37oC5% CO2 培养箱培养46小时。(不能超过6个小时)

4)混匀,加入 20µl CD3-TC 20µl CD8-FITC,
室温,避光孵育 15 分钟

5)分成 4 管,每管加入 100µl 已染色的全血,
编号为 A1A2A3 A4

6)每管中加入 100µl Fix&Perm 中的 Reagent A(即固定液),室温,避光孵育 15 分钟

7)每管中加入 3mL PBS 1200 rpm 离心 5 分钟,弃除上清。(此时需用剩余的些许 PBS 轻轻震荡来重悬细胞,以免在后面的步骤中造成重悬细胞困难)

8)每管中加入 100µl Fix&Perm 中的 Reagent B( 即破膜和溶血液),同时各管中按下表加入相应的抗体


9)室温,避光孵育15分钟。每管中加入 3mL PBS1200 rpm 离心 5 分钟,弃除上清

10)0.5mL PBS 重悬细胞,上机检测

b.2
四色法

1)
全血标本:取 100ul 全血标本于试管中,用 RPMI 1640(不含小牛血清-FBS) 1:1 等体积稀释;PBMC 标本:取 200ul PBMC(2 x 106细胞/ml)于试管中

2)
加入 5µl 1µg/mlPMA工作液+ 4µl 50µg/ml Ionomycin 工作液
+ 3.4 µl 0.1mg/ml Monensin
工作液(4µl 0.5mg/ml BFA 工作液),混匀

3)
3
75% CO2 培养箱培养46小时。(不能超过 6 个小时)

4)混匀,加入 10µl CD3-APC 10µl CD8-TC(BD机器) 10µl CD3-TC 10µl CD8-PE-TR(Coulter 机器),
室温,避光孵育 15 分钟

5)分成 2 管,每管加入 100µl 已染色的全血,编号为 A1 A2

6)每管中加入 100µl Fix&Perm 中的 Reagent A(即固定液)  室温,避光孵育 15 分钟

7)每管中加入 3mL PBS 1200 rpm 离心 5 分钟,弃除上清。(此时需用剩余的些许 PBS 轻轻震荡来重悬细胞,以免在后面的步骤中造成重悬细胞困难)

8)每管中加入 100µl Fix&Perm 中的 Reagent B( 即破膜和溶血液),同时各管中按下表加入相应的抗体各10ul


9)室温,避光孵育 15 分钟。每管中加入 3mL PBS1200 rpm 离心 5 分钟,弃除上清

10)0.5mL PBS 重悬细胞,上机检测

【结果分析】 

以三色法为例,如图2

1)
如图 2A, R1 区域选定 CD3+T 细胞,选择时注意两点:

l
T 细胞为淋巴细胞中的一个群体,因此其 SSC 应与淋巴细胞相似,比较小,所以在设定 R1 区域时应排除 SSC 较大的部分

l
PMA 刺激后,红细胞膜不容易破裂,在溶血时很难破坏红细胞,因此最好不要用图 2D 来选定淋巴细胞群,否则会造成较大误差

2) 如图2B设门于R1,即仅分析R1区域内的细胞,得出Th1Tc1CD3+T细胞中的比例

3) 如图2C,设门于 R1,即仅分析 R1 区域内的细胞,得出Th2Tc2CD3+T 细胞中的比例。

注:

1)采集数据时应先用同型对照来设定电压和阳性区,然后再分析相应的抗体组。

2)四色法分析与三色法相似,但可增加 IFN-/IL-4 的双参数点图,来分析
Th0
细胞的比例,CD3+CD8-IFN-g+IL-4+细胞。


【质控】

质控一般在以下两个步骤中进行:

1) PMA+Ionomycin
的刺激效果

在检测 Th1/Th2 Tc1/Tc2时,质控是极其重要的,因为刺激的效果及破膜染色的操作如何,均会影响结果的稳定性。

a)
取肝素抗凝血 100µl,
100µl RPMI 1640 稀释一倍

b)
加入 5µl 1µg/mlPMA 工作液
+ 4µl 50µg/ml Ionomycin
工作液,混匀

c)
37oC
5% CO2 培养箱培养 46 小时。(不能超过 6 个小时)

d)
混匀,分成 A, B 两管,每管加 100µl 刺激过的全血,A 管为阴性对照管,B 管为检测管。

e)
A
管中加10µl Mouse IgG2a-PE 5µl CD3-APC(BD 机器)5µl CD3-TC(Coulter 机器)B管中加 CD69-PE CD3-APC(BD 机器) CD3-TC(Coulter 机器),
5µl

f)
室温,避光孵育 15 分钟

g)
PBS
离心洗涤一次,0.5 mLPBS重悬上机

2)破膜染色的效果

a)
取肝素抗凝血 100µl,
100µl RPMI 1640 稀释一倍

b)
加入5µl 1µg/mlPMA 工作液+ 4µl 50µg/ml Ionomycin 工作液+ 3.4 µl 0.1mg/ml Monensin 工作液( 4µl 0.5mg/ml BFA 工作液),混匀

c)
3
75% CO2 培养箱培养 46 小时。(不能超过 6 个小时)

d)
混匀,加入10µl CD3-APC(BD 机器)10µl CD3-TC(Coulter机器),室温,避光孵育15分钟

e)
分成 A, B两管,每管加 100µl 染色过的全血,A管为阴性对照管,B管为检测管。

f)
两管中均加入 100µl Fix&Perm 中的Reagent A(即固定液),室温,避光孵育15 分钟

g)
两管中均加入 3mL PBS1200 rpm 离心 5 分钟,弃除上清。(此时需用剩余的些许 PBS 轻轻震荡来重悬细胞,以免在后面的步骤中造成重悬细胞困难)

h)
两管中均加入 100µl Fix&Perm 中的 Reagent B( 即破膜和溶血液),同时在 A 管中加入 Mouse IgG2a-PE 10µl,在 B 管中加 CD69-PE 5µl

i)
室温,避光孵育 15 分钟

j)
两管中均加入 3mL PBS1200 rpm 离心 5 分钟,弃除上清

k)
0.5mL PBS
重悬细胞,上机检测

l
质控结果分析

如图 2A 选定 R1 区域,即 CD3+T 细胞,然后再建立一个单参数直方图,分析 R1 区域内 CD69的表达情况。如 PMA+Ionomycin 的刺激效果较好,则 CD69 CD3+T 细胞中的表达率应>90%(第一步质控);第一步质控较好时,可进行第二步质控,即破膜后观察 CD69 CD3+T 细胞的百分率,其值也应>90%。任何一步的质控结果不理想,均需查找原因,暂停正式的检测实验。

3. 其它相关细胞因子的检测

IFN- IL-4 外,IL-1aIL-1bIL-2IL-6IL-10IL-12 TNF-等也是 Th1/Th2 Tc1/Tc2 所分泌的细胞因子,虽然不是非常特异,但在某些疾病中同样发挥着重要的作用,因此也有检测的必要。


检测这些细胞因子时,要注意所用的刺激剂及刺激方法与 IFN- IL-4
有所不同,因 PMA+Ionomycin不一定能使这些细胞因子达到最大分泌。所以需参照下表(
9)
,根据不同的细胞因子,选择最佳的刺激方法。

 

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